MRE11 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401510-ACT

MRE11 codifica una nucleasi conservata che forma il complesso MRE11–RAD50–NBN (MRN), un sensore ed effettore centrale della riparazione delle rotture a doppio filamento del DNA. Grazie ai suoi ruoli nella processazione delle estremità del DNA, nella segnalazione dei checkpoint ATM/ATR, nella ricombinazione omologa e nel mantenimento dei telomeri, MRE11 contribuisce a preservare la stabilità del genoma in condizioni di stress replicativo e di sfida genotossica. Un’alterata funzione del complesso MRN è associata a risposte al danno al DNA difettose, instabilità cromosomica e fenotipi legati al cancro, e l’attività di MRE11 viene frequentemente studiata nelle ricerche sulla dinamica delle forcelle di replicazione e sui processi di riparazione associati alla cromatina. Di conseguenza, MRE11 rappresenta un nodo chiave per analizzare il crosstalk tra le vie della DDR e i meccanismi di sensibilità cellulare alle perturbazioni che danneggiano il DNA.

MRE11 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di MRE11 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

MRE11 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus MRE11 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione MRE11, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di MRE11. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus MRE11 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da MRE11 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via MRE11 nelle cellule tumorali con espressione di MRE11 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.