Mms2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404777-ACT

UBE2V2 codifica Mms2, una variante dell’enzima E2 coniugante l’ubiquitina priva di attività catalitica, ma capace di formare un eterodimero funzionale con UBE2N/UBC13 per promuovere l’assemblaggio di catene di poliubiquitina legate a K63. Questa segnalazione dell’ubiquitina non proteolitica supporta la tolleranza e la riparazione del danno al DNA, inclusa la riparazione post-replicativa e il bypass delle lesioni privo di errori mediato dall’ubiquitinazione di PCNA. La formazione di catene di ubiquitina dipendente da Mms2 contribuisce anche a reti di segnalazione responsiva allo stress che si intersecano con la stabilità del genoma e il controllo dei checkpoint del ciclo cellulare. La deregolazione delle vie di riparazione del DNA mediate dall’ubiquitina che coinvolgono UBE2V2 è stata associata a un carico mutazionale alterato e a una sensibilità cellulare modificata allo stress genotossico, rendendolo rilevante per studi meccanicistici in biologia del cancro e nei disturbi della riparazione del DNA.

Mms2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di UBE2V2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Mms2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus UBE2V2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione UBE2V2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Mms2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus UBE2V2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Mms2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Mms2 nelle cellule tumorali con espressione di UBE2V2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.