MLH3 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-432245-ACT

Mlh3 codifica per MLH3, un fattore di riparazione degli appaiamenti errati del DNA della famiglia MutL che forma un eterodimero con MLH1 e contribuisce al mantenimento del genoma tramite la mismatch repair e la ricombinazione meiotica. Durante la meiosi, MLH1–MLH3 promuove la formazione di crossing-over di classe I, mentre nelle cellule somatiche partecipa alla sorveglianza post-replicativa che limita l’accumulo di mutazioni e preserva la stabilità cromosomica. MLH3 interagisce inoltre con vie coinvolte nella risposta allo stress replicativo e al danno al DNA, collegando la capacità di riparazione alla progressione del ciclo cellulare. Un’alterata funzione di MLH3 è stata associata a difetti della mismatch repair, a fenotipi di instabilità genomica e a una maggiore suscettibilità a processi patologici guidati da mutazioni, rilevanti per la biologia del cancro e per la ricerca in genetica riproduttiva.

MLH3 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Mlh3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

MLH3 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Mlh3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Mlh3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di MLH3. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Mlh3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da MLH3 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via MLH3 nelle cellule tumorali con espressione di Mlh3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.