MKP-3 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400850-ACT

La fosfatasi a duplice specificità 6 (DUSP6), nota anche come MKP-3, è una fosfatasi citosolica delle MAP chinasi che de-fosforila e inattiva preferenzialmente ERK1/2, fornendo un controllo a feedback negativo della cascata di segnalazione RAS–RAF–MEK–ERK. Limitando i programmi trascrizionali guidati da ERK, MKP-3 influenza la proliferazione, la differenziazione e la dinamica della segnalazione dipendente dallo stimolo a valle di recettori tirosin-chinasici come EGFR e FGFR. Alterazioni nell’espressione o nell’attività di DUSP6 possono rimodellare l’output della via MAPK e sono state riportate in contesti in cui la segnalazione ERK è disregolata, inclusi molteplici modelli associati al cancro e studi sulla segnalazione nello sviluppo. In quanto modulatore di via, DUSP6 è spesso utilizzata per indagare la regolazione a feedback della MAPK e l’adattamento della segnalazione.

MKP-3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di DUSP6 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

MKP-3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus DUSP6 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione DUSP6, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di MKP-3. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus DUSP6 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da MKP-3 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via MKP-3 nelle cellule tumorali con espressione di DUSP6 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.