mitoNEET Plasmide Double Nickase (m): sc-424640-NIC

Il gene murino Cisd1 codifica mitoNEET, una proteina legante cluster [2Fe–2S] ancorata alla membrana mitocondriale esterna, che partecipa al trasferimento dei cluster ferro‑zolfo, alla regolazione redox e al coordinamento della bioenergetica mitocondriale con lo stato metabolico della cellula. mitoNEET influenza la morfologia mitocondriale e la capacità ossidativa, interfacciandosi con vie che controllano la gestione delle specie reattive dell’ossigeno, l’utilizzo dei lipidi e l’omeostasi del ferro. La disregolazione dei processi associati a CISD1/mitoNEET è stata collegata in letteratura a disfunzioni metaboliche, risposte allo stress mitocondriale e fenotipi rilevanti per la neurodegenerazione, rendendolo un nodo utile per studi meccanicistici della segnalazione mitocondriale. Nei modelli murini, la perturbazione di Cisd1 può essere sfruttata per analizzare come il controllo redox della membrana mitocondriale esterna plasmi la fisiologia cellulare in tessuti ad alta richiesta metabolica.

mitoNEET Il plasmide Double Nickase (m) consiste in una coppia di plasmidi ingegnerizzati per l'editing ad alta specificità del locus Cisd1 nelle linee cellulari mouse. Ciascun plasmide esprime una nickasi Cas9 D10A e un sgRNA distinto che prende di mira filamenti di DNA opposti all'interno di Cisd1. Quando indirizzate verso siti adiacenti su filamenti di DNA opposti, le due nickasi generano tagli a filamento singolo sfalsati che insieme producono una rottura a doppio filamento sfalsata, richiedendo un'attività coordinata sul bersaglio da entrambe le guide. La rottura del DNA risultante viene risolta da vie di riparazione cellulare endogene, più comunemente attraverso la giunzione non omologa delle estremità (NHEJ), portando a inserzioni o delezioni che interrompono la funzione di Cisd1. Richiedendo il coinvolgimento di due sgRNA nel locus bersaglio, l'approccio a doppia nickasi migliora la specificità dell'editing e fornisce una strategia CRISPR complementare per applicazioni in cui è desiderato un controllo aggiuntivo sulla precisione del targeting.

Per supportare l'identificazione efficiente delle cellule modificate, un plasmide codifica la GFP per la visualizzazione fluorescente delle popolazioni trasfettate, mentre il plasmide di accompagnamento porta un gene di resistenza alla puromicina per la selezione antibiotica. Insieme, queste caratteristiche supportano l'arricchimento efficiente delle popolazioni co-trasfettate e semplificano la convalida dei cloni con Cisd1 interrotto.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.