MGMT Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400720-ACT

MGMT (O6-metilguanina-DNA metiltransferasi) è una proteina di riparazione del DNA conservata che rimuove gli addotti alchilici dalla posizione O6 della guanina tramite un meccanismo di inversione diretta, ripristinando la correttezza dell’appaiamento delle basi e limitando la mutagenesi. In quanto enzima “suicida” che trasferisce il gruppo alchilico a una cisteina del sito attivo, MGMT influenza le risposte cellulari allo stress da alchilazione endogeno ed esogeno e si integra con i programmi di mantenimento del genoma che modulano la progressione del ciclo cellulare e la segnalazione del danno al DNA. Le variazioni nell’espressione di MGMT e nella regolazione del suo promotore sono state collegate a una diversa suscettibilità all’accumulo di mutazioni e all’instabilità genomica in molteplici contesti patologici, rendendolo un nodo chiave per lo studio della capacità di riparazione del DNA. MGMT è inoltre ampiamente utilizzato come readout funzionale nei pathway che governano la tolleranza allo stress genotossico e il controllo epigenetico dell’espressione dei geni di riparazione del DNA.

MGMT Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di MGMT senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

MGMT Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus MGMT nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione MGMT, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di MGMT. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus MGMT nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da MGMT nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via MGMT nelle cellule tumorali con espressione di MGMT silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.