MEK-1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400397-ACT

MAP2K1 codifica per MEK-1, una chinasi a doppia specificità che fosforila e attiva ERK1/2 all’interno della cascata MAPK canonica RAS–RAF–MEK–ERK. MEK-1 integra segnali provenienti dai recettori tirosin-chinasici e dalle GTPasi della famiglia RAS per regolare proliferazione, differenziamento, sopravvivenza e programmi trascrizionali dipendenti dallo stimolo. Un controllo rigoroso dell’attività e dell’espressione di MEK-1 è fondamentale per una corretta progressione del ciclo cellulare e per la regolazione a feedback nelle reti di segnalazione MAPK. La disregolazione della segnalazione MAP2K1/MEK-1 è spesso studiata in contesti di attivazione oncogenica della via MAPK, disturbi dello sviluppo e meccanismi di rimodellamento acquisito della segnalazione.

MEK-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di MAP2K1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

MEK-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus MAP2K1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione MAP2K1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di MEK-1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus MAP2K1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da MEK-1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via MEK-1 nelle cellule tumorali con espressione di MAP2K1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.