megalin/LRP2 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-420631-ACT

Lrp2 nel topo codifica megalina/LRP2, un grande recettore endocitico della famiglia dei recettori LDL che media, in modo dipendente dalla clatrina, l’assorbimento di numerosi ligandi, inclusi trasportatori di vitamine, lipoproteine e morfogeni. È altamente espresso negli epiteli assorbenti, come i tubuli prossimali renali, e contribuisce al riassorbimento mediato da recettore, all’omeostasi dei nutrienti e alla regolazione della disponibilità extracellulare dei ligandi. Megalina/LRP2 interagisce con le reti di segnalazione e di traffico coinvolte nello sviluppo, incluse le vie di Sonic hedgehog e dei retinoidi, controllando l’internalizzazione dei ligandi e la competenza della segnalazione a valle. Un’attività di Lrp2 deregolata è stata associata a difetti nel trasporto epiteliale e nella definizione dei pattern di sviluppo, a supporto della sua rilevanza in modelli di disfunzione renale e del neurosviluppo.

megalin/LRP2 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Lrp2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

megalin/LRP2 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Lrp2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Lrp2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di megalin/LRP2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Lrp2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da megalin/LRP2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via megalin/LRP2 nelle cellule tumorali con espressione di Lrp2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.