MCR Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400672-ACT

NR3C2 codifica il recettore dei mineralcorticoidi (MCR), un fattore di trascrizione recettoriale nucleare attivato da ligando che risponde principalmente all’aldosterone e partecipa alla segnalazione dei glucocorticoidi in modo dipendente dal tessuto. Una volta attivato, l’MCR trasloca nel nucleo e si lega a elementi di risposta ormonale per regolare geni che controllano il trasporto epiteliale di sodio, l’omeostasi del potassio, l’equilibrio dei fluidi e la regolazione della pressione arteriosa, incluse vie che convergono sull’attività di ENaC e della Na⁺/K⁺-ATPasi. La segnalazione di NR3C2 interseca inoltre programmi genici infiammatori e fibrotici nei tessuti cardiovascolari, renali e neuronali attraverso un crosstalk dipendente dal contesto con MAPK e altri regolatori trascrizionali. La disregolazione o le mutazioni di NR3C2 sono implicate in disturbi della gestione dei sali e del controllo pressorio e vengono studiate nei meccanismi delle patologie renali e cardiache, nella neurobiologia della risposta allo stress e nella regolazione endocrina.

MCR Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di NR3C2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

MCR Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus NR3C2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione NR3C2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di MCR. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus NR3C2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da MCR nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via MCR nelle cellule tumorali con espressione di NR3C2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.