MBD3 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401072-ACT

Il gene umano **MBD3** codifica la proteina 3 contenente il dominio di legame al metil-CpG, un componente centrale del complesso **NuRD** (nucleosome remodeling and deacetylase), che integra il rimodellamento della cromatina dipendente da ATP con la deacetilazione degli istoni per regolare i programmi trascrizionali. MBD3 contribuisce al controllo epigenetico dell’identità cellulare, incluse differenziazione e transizioni di pluripotenza, coordinando la repressione o lo “stato di prontezza” (poising) dei geni a livello di promotori ed enhancer e influenzando l’accessibilità della cromatina. Attraverso il suo ruolo nell’organizzazione della cromatina, MBD3 si interseca con vie che regolano le risposte al danno del DNA, la tempistica di replicazione e le reti geniche dello sviluppo. Un’attività deregolata di NuRD/MBD3 è stata associata a stati trascrizionali aberranti nel cancro e a fenotipi neuroevolutivi, rendendolo rilevante per studi sui meccanismi epigenetici alla base di cambiamenti dell’espressione genica associati a malattie.

MBD3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di MBD3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

MBD3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus MBD3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione MBD3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di MBD3. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus MBD3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da MBD3 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via MBD3 nelle cellule tumorali con espressione di MBD3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.