MaxiKβ Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403096-ACT

KCNMB1 codifica la subunità ausiliaria β1 dei canali del potassio a grande conduttanza attivati da calcio e voltaggio (BK/MaxiK), comunemente indicata come MaxiKβ. Aumentando la sensibilità del canale al calcio e modificandone la cinetica di gating, MaxiKβ regola l’eccitabilità di membrana e l’efflusso di potassio nella muscolatura liscia e in altri tessuti eccitabili, influenzando così il tono vascolare, la reattività delle vie aeree e la gestione del calcio intracellulare. Questa attività modulatrice collega KCNMB1 a processi di segnalazione che integrano la dinamica del Ca2+ intracellulare con il potenziale di membrana, incluse le vie che controllano l’accoppiamento contrazione–rilassamento e l’iperpolarizzazione dipendente dallo stimolo. L’alterata regolazione dei canali BK e le varianti di KCNMB1 sono state studiate in relazione a fenotipi cardiovascolari e legati alla muscolatura liscia, a supporto della sua rilevanza per studi meccanicistici sulla regolazione dei canali ionici e sulla biologia delle malattie associate all’eccitabilità.

MaxiKβ Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di KCNMB1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

MaxiKβ Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus KCNMB1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione KCNMB1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di MaxiKβ. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus KCNMB1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da MaxiKβ nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via MaxiKβ nelle cellule tumorali con espressione di KCNMB1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.