MARCH9 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-410240-ACT

MARCH9 codifica una ligasi E3 dell’ubiquitina RING-CH associata alla membrana, che si localizza sulle membrane endosomiali e lisosomiali, dove regola il turnover e il traffico delle proteine attraverso uno smistamento dipendente dall’ubiquitina. Ubiquitinando specifiche proteine di membrana, MARCH9 contribuisce al riciclo endocitico, al targeting lisosomiale e a un controllo più ampio della proteostasi, intersecandosi con vie che regolano la dinamica delle vescicole e la disponibilità in superficie di recettori rilevanti per la risposta immunitaria. Un’alterata regolazione delle ligasi dell’ubiquitina e del traffico di membrana è stata collegata a segnali deregolati e a risposte allo stress osservate in diversi contesti patologici, a supporto dell’uso di MARCH9 come nodo per studiare il controllo dell’omeostasi cellulare mediato dall’ubiquitina. Lo studio dell’espressione e dell’attività di MARCH9 può chiarire i meccanismi che collegano il trasporto vescicolare agli output di segnalazione e ai cambiamenti dello stato cellulare.

MARCH9 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di MARCH9 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

MARCH9 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus MARCH9 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione MARCH9, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di MARCH9. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus MARCH9 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da MARCH9 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via MARCH9 nelle cellule tumorali con espressione di MARCH9 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.