Plásmido CRISPR de Activación (h) MARCH9: sc-410240-ACT

MARCH9 codifica una ligasa E3 de ubiquitina RING-CH asociada a membrana que se localiza en las membranas endosomales y lisosomales, donde regula el recambio y el tráfico de proteínas mediante clasificación dependiente de ubiquitina. Al ubiquitinar proteínas de membrana seleccionadas, MARCH9 contribuye al reciclaje endocítico, al direccionamiento hacia lisosomas y a un control más amplio de la proteostasis, conectando con vías que gobiernan la dinámica vesicular y la disponibilidad de receptores de superficie relevantes para la respuesta inmunitaria. La regulación alterada de las ligasas de ubiquitina y del tráfico de membrana se ha vinculado con señales desreguladas y respuestas al estrés observadas en diversos contextos de enfermedad, lo que respalda el uso de MARCH9 como un nodo para explorar el control de la homeostasis celular mediado por ubiquitina. Estudiar la expresión y la actividad de MARCH9 puede aclarar mecanismos que acoplan el transporte vesicular con las salidas de señalización y los cambios en el estado celular.

MARCH9 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de MARCH9 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

MARCH9 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus MARCH9 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional MARCH9, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de MARCH9. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo MARCH9 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de MARCH9 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía MARCH9 en células tumorales con expresión de MARCH9 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.