MANEA Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-413213-ACT

MANEA (endo-α mannosidasi) codifica un’endo-α-1,2-mannosidasi residente nel Golgi che rimuove residui dai N-glicani ad alto contenuto di mannosio glucosilati durante la maturazione delle glicoproteine. Offrendo un’alternativa alla via di processamento dipendente dalle glucosidasi del reticolo endoplasmatico (RE), MANEA contribuisce a coordinare il controllo di qualità della glicosilazione N-linked e influenza il ripiegamento, il traffico e la secrezione delle proteine. Questa attività collega MANEA all’omeostasi della via secretoria e alle reti di proteostasi che determinano la composizione dei recettori di membrana e gli output di segnalazione. Un processamento dei glicani deregolato è stato associato a un’alterata immunoriconoscibilità, a fenotipi metabolici e a una patobiologia più ampia in cui la maturazione e il traffico delle glicoproteine risultano compromessi.

MANEA Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di MANEA senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

MANEA Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus MANEA nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione MANEA, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di MANEA. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus MANEA nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da MANEA nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via MANEA nelle cellule tumorali con espressione di MANEA silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.