MAGE-A3 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402571-ACT

MAGEA3 codifica MAGE-A3, un antigene cancro-testis tipicamente silenziato nei tessuti somatici adulti ma inducibile in molte neoplasie attraverso deregolazione epigenetica. MAGE-A3 è implicato nel controllo della trascrizione e della proteostasi tramite l’attivazione di moduli di segnalazione della famiglia MAGE, in grado di modulare l’attività delle ligasi E3 dell’ubiquitina e di influenzare il turnover proteico, le risposte allo stress e i programmi associati al ciclo cellulare. La sua espressione è spesso collegata ad alterazioni della presentazione dell’antigene e degli stati di riconoscimento immunitario, rendendolo un utile indicatore molecolare per lo studio della regolazione genica associata al tumore. In quanto marcatore altamente ristretto per linea cellulare e associato alla malattia, MAGEA3 rappresenta un locus modello per indagare la regolazione della cromatina, la riattivazione trascrizionale e il rimodellamento delle vie a valle nelle cellule umane.

MAGE-A3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di MAGEA3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

MAGE-A3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus MAGEA3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione MAGEA3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di MAGE-A3. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus MAGEA3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da MAGE-A3 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via MAGE-A3 nelle cellule tumorali con espressione di MAGEA3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.