MAD2 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401027-ACT

O MAD2L1 humano codifica a MAD2, um componente central do checkpoint de montagem do fuso mitótico, que monitora a ligação cinetócoro–microtúbulo e atrasa o início da anáfase até que os cromossomos atinjam a biorientação. A MAD2 participa da formação do complexo do checkpoint mitótico para inibir a atividade do APC/C-CDC20, coordenando assim a estabilidade da ciclina B e da securina, a segregação cromossômica e a manutenção da integridade genômica. A desregulação da expressão de MAD2L1 ou da sinalização do checkpoint pode promover instabilidade cromossômica e aneuploidia, características frequentemente observadas na biologia de doenças proliferativas. Como resultado, o MAD2L1 é amplamente estudado em vias que controlam a progressão do ciclo celular, o timing mitótico e a vigilância do genoma.

MAD2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de MAD2L1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

MAD2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus MAD2L1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição MAD2L1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de MAD2. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus MAD2L1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de MAD2 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via MAD2 em células tumorais com expressão de MAD2L1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.