MAD1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401885-ACT

Il gene umano **MAD1L1** codifica la proteina *mitotic arrest deficient 1* (MAD1), un componente centrale del checkpoint di assemblaggio del fuso mitotico, che tutela la corretta segregazione dei cromosomi monitorando l’aggancio tra cinetocori e microtubuli. MAD1 coopera con MAD2 e altri fattori del checkpoint per promuovere la formazione del complesso di controllo mitotico e inibire l’attività di APC/C-CDC20 finché non viene raggiunta la corretta biorientazione, limitando così l’aneuploidia e l’instabilità cromosomica. Grazie ai suoi ruoli nella tempistica mitotica e nella segnalazione del checkpoint, MAD1L1 è spesso studiato in vie che collegano il mantenimento del genoma alla progressione del ciclo cellulare. La disregolazione del controllo del checkpoint associato a MAD1L1 è stata implicata in fenotipi di instabilità cromosomica osservati in molteplici contesti tumorali e in modelli con fedeltà mitotica compromessa.

MAD1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di MAD1L1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

MAD1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus MAD1L1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione MAD1L1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di MAD1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus MAD1L1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da MAD1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via MAD1 nelle cellule tumorali con espressione di MAD1L1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.