mAChR M1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401453-ACT

CHRM1 codifica il recettore muscarinico umano dell’acetilcolina M1 (mAChR M1), un recettore accoppiato a proteine G che segnala principalmente attraverso Gq/11 per attivare la fosfolipasi C, aumentare il Ca2+ intracellulare e stimolare cascate dipendenti da PKC. Gli effetti a valle includono la modulazione della segnalazione MAPK/ERK, il turnover dei fosfoinositidi e programmi trascrizionali dipendenti dall’attività che modellano l’eccitabilità neuronale e la plasticità sinaptica. mAChR M1 influenza anche la regolazione colinergica dei circuiti corticali e ippocampali, oltre a risposte secretorie e della muscolatura liscia nei tessuti periferici. Alterazioni dell’espressione o della segnalazione di CHRM1 sono state chiamate in causa in contesti di ricerca neuropsichiatrica e neurodegenerativa, inclusi studi su cognizione, attenzione e disfunzione colinergica.

mAChR M1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CHRM1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

mAChR M1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CHRM1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CHRM1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di mAChR M1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CHRM1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da mAChR M1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via mAChR M1 nelle cellule tumorali con espressione di CHRM1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.