Lyst Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-410730-ACT

Il gene umano **LYST** (lysosomal trafficking regulator) codifica **Lyst**, una grande proteina citosolica che controlla le dimensioni, il posizionamento e la dinamica di membrana degli organelli correlati ai lisosomi, necessari per la fusione tra endosoma tardivo e lisosoma e per il traffico del carico. Regolando gli eventi di fissione e fusione delle vescicole, Lyst influenza la funzione degradativa dei lisosomi, la processazione dell’antigene e la secrezione da granuli specializzati nelle cellule immunitarie e pigmentarie. Un’attività di **LYST** deregolata è associata a difetti dell’omeostasi lisosomiale e alla formazione anomala di granuli giganti, che compromettono la funzione delle cellule dell’immunità innata e adattativa, rendendolo rilevante per studi su immunodeficienza e biologia della pigmentazione. **LYST** è quindi spesso analizzato nei pathway che governano il traffico intracellulare, il crosstalk tra autofagia e lisosomi e le risposte allo stress dovute a un turnover organellare compromesso.

Lyst Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di LYST senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Lyst Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus LYST nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione LYST, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Lyst. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus LYST nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Lyst nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Lyst nelle cellule tumorali con espressione di LYST silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.