Plasmide CRISPR d'Activation (h) Lubricin: sc-402340-ACT

PRG4 code la lubricine, une glycoprotéine sécrétée de type mucine, enrichie dans le liquide synovial et à la surface du cartilage, où elle assure la lubrification limite et protège les tissus des lésions dues aux forces de cisaillement. La lubricine contribue à l’homéostasie de la matrice extracellulaire en limitant l’adsorption des protéines et l’adhérence cellulaire, modulant les interactions des chondrocytes et des synoviocytes avec le microenvironnement articulaire. Une expression modifiée de PRG4 ou des altérations de la composition de la lubricine ont été associées à des phénotypes de dégénérescence articulaire et d’inflammation synoviale, et sont fréquemment étudiées dans le cadre de l’arthrose et de modèles de lésion cartilagineuse. Au-delà de la biologie musculosquelettique, PRG4 est utilisé comme marqueur de populations cellulaires spécialisées dans la lubrification et pour étudier comment les contraintes mécaniques remodèlent les programmes sécrétoires et associés à la matrice.

Lubricin Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de PRG4 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Lubricin Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus PRG4 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription PRG4, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Lubricin. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus PRG4 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Lubricin au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Lubricin dans les cellules tumorales présentant une expression de PRG4 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.