LTBP-3 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-421482-ACT

Ltbp3 codifica la latent transforming growth factor beta binding protein 3 (LTBP-3), una glicoproteina della matrice extracellulare che lega i complessi latenti di TGF-β e ne regola il sequestro, l’attivazione e la presentazione spaziale nel microambiente tissutale. Controllando la biodisponibilità del TGF-β, LTBP-3 influenza la segnalazione SMAD-dipendente, il rimodellamento della matrice e le decisioni sul destino cellulare durante lo sviluppo e l’omeostasi dei tessuti. Studi nel topo collegano LTBP-3 alla definizione del pattern scheletrico, all’integrità del tessuto connettivo e alla biologia vascolare, a riflesso del suo ruolo nel coordinare la segnalazione dei fattori di crescita con l’organizzazione della matrice extracellulare. Un’attività disregolata dell’asse LTBP-3–TGF-β è rilevante, in contesti di ricerca meccanicistica, per rimodellamenti di tipo fibrotico, osteogenesi aberrante e segnalazione stromale associata ai tumori.

LTBP-3 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Ltbp3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

LTBP-3 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Ltbp3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Ltbp3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di LTBP-3. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Ltbp3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da LTBP-3 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via LTBP-3 nelle cellule tumorali con espressione di Ltbp3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.