LRRC59 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404821-ACT

LRRC59 (leucine rich repeat containing 59) codifica una proteina di membrana associata al reticolo endoplasmatico e all’involucro nucleare, implicata nel targeting proteico e nel traffico associato alle membrane sul lato citoplasmatico del RE. LRRC59 è stata collegata al reclutamento dei ribosomi e a processi co-traduzionali che supportano la biogenesi di proteine secretorie e di membrana, mettendola in relazione con l’omeostasi del RE e con le reti di proteostasi. Grazie alla sua localizzazione all’interfaccia tra RE e involucro nucleare, LRRC59 viene inoltre studiata nel contesto dell’organizzazione nucleo-citoplasmatica e del rimodellamento del sistema endomembranoso in risposta allo stress. Una proteostasi del RE deregolata e programmi di traffico alterati sono caratteristiche ricorrenti nella ricerca su cancro e neurodegenerazione, rendendo LRRC59 un nodo utile per analizzare cambiamenti a livello di vie in questi processi rilevanti per la malattia.

LRRC59 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di LRRC59 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

LRRC59 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus LRRC59 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione LRRC59, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di LRRC59. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus LRRC59 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da LRRC59 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via LRRC59 nelle cellule tumorali con espressione di LRRC59 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.