LRP Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-429657-ACT

Mvp del topo codifica LRP (major vault protein), il principale componente strutturale delle particelle ribonucleoproteiche “vault”, implicate nel traffico citoplasmatico, nel trasporto nucleo-citoplasmatico e nella segnalazione in risposta allo stress. LRP interagisce con vie che regolano la gestione degli xenobiotici e l’omeostasi cellulare, inclusi i processi di trasporto dei farmaci e di detossificazione, ed è stata collegata, in alcuni contesti, alla modulazione di risposte associate a PI3K/AKT e MAPK. Un’espressione alterata di MVP/LRP è stata associata a fenotipi di resistenza multidrug e a cambiamenti nella sensibilità all’apoptosi, rendendola rilevante per studi sull’adattamento delle cellule tumorali e sulla risposta ai trattamenti. Nei sistemi immunitari ed epiteliali, la biologia delle particelle vault è inoltre connessa a programmi di difesa innata e alla segnalazione legata all’infiammazione, a supporto di indagini che spaziano dai modelli di cancro a quelli di risposta dell’ospite.

LRP Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Mvp senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

LRP Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Mvp nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Mvp, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di LRP. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Mvp nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da LRP nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via LRP nelle cellule tumorali con espressione di Mvp silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.