LOC285636 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-415435-ACT

C5orf51 (LOC285636) è un locus umano scarsamente caratterizzato che sembra codificare una proteina a bassa abbondanza, con un’annotazione funzionale limitata nelle banche dati attuali. Osservazioni emergenti a livello di trascritto suggeriscono un’espressione dipendente dal tipo cellulare e dal contesto, indicando potenziali ruoli in reti regolatorie che modellano lo stato cellulare più che nel metabolismo “housekeeping” di base. Come per molti open reading frame non caratterizzati, sono stati riportati pattern di espressione alterati in diversi dataset provenienti da molteplici contesti patologici, a supporto della sua priorità per studi meccanicistici sulla regolazione genica e sull’associazione con i fenotipi. Definire la funzione di LOC285636 può aiutare a mappare il controllo trascrizionale a monte e gli effetti sulle vie a valle rilevanti per la proliferazione, le risposte allo stress e i programmi di differenziamento cellulare.

LOC285636 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di C5orf51 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

LOC285636 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus C5orf51 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione C5orf51, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di LOC285636. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus C5orf51 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da LOC285636 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via LOC285636 nelle cellule tumorali con espressione di C5orf51 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.