LOC285636 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-415435-ACT

C5orf51 (LOC285636) é um locus humano pouco caracterizado que aparentemente codifica uma proteína de baixa abundância, com anotação funcional limitada nas bases de dados atuais. Observações emergentes ao nível de transcritos sugerem expressão dependente do tipo celular e do contexto, indicando possíveis papéis em redes regulatórias que moldam o estado celular, mais do que no metabolismo básico de manutenção. Como acontece com muitas ORFs não caracterizadas, foram reportadas alterações nos padrões de expressão em vários conjuntos de dados provenientes de diferentes contextos de doença, o que reforça a sua priorização para estudos mecanísticos de regulação génica e associação com fenótipos. Definir a função de LOC285636 pode ajudar a mapear o controlo transcricional a montante e os efeitos em vias a jusante relevantes para proliferação, respostas ao stress e programas de diferenciação celular.

LOC285636 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de C5orf51 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

LOC285636 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus C5orf51 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição C5orf51, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de LOC285636. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus C5orf51 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de LOC285636 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via LOC285636 em células tumorais com expressão de C5orf51 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.