LMP7 Particelle di Attivazione Lentivirale (m): sc-421450-LAC

Il gene murino Psmb8 codifica LMP7 (β5i), una subunità catalitica dell’immunoproteasoma inducibile dall’interferone-γ che sostituisce la subunità costitutiva PSMB5 per rimodellare la specificità di taglio del proteasoma. Modellando il repertorio di peptidi generati per il caricamento su MHC di classe I, LMP7 supporta le vie di processamento e presentazione dell’antigene e influenza la sorveglianza immunitaria diretta dalle cellule T CD8+. L’attività di LMP7 si integra con il funzionamento del sistema ubiquitina–proteasoma, con l’assemblaggio dell’immunoproteasoma e con i programmi di segnalazione infiammatoria nei tessuti immunitari e non immunitari. Un’alterata regolazione di PSMB8/LMP7 è stata associata a un’infiammazione deregolata e a patologie immuno-mediate, rendendolo un nodo utile per studi meccanicistici sulla proteostasi e sulla presentazione dell’antigene.

Le particelle di attivazione lentivirale LMP7 (m) rispondono a questa esigenza incapsulando il sistema completo di attivazione trascrizionale del mediatore di attivazione sinergica (SAM) in particelle lentivirali ad alto titolo pronte per la trasduzione, consentendo un'efficiente sovraregolazione di Psmb8 in una gamma più ampia di tipi di cellule umane.

Le particelle di attivazione lentivirale LMP7 (m) veicolano tutti i componenti funzionali del sistema del mediatore di attivazione sinergica (SAM) tramite trasduzione lentivirale. Il sistema comprende tre preparati di particelle co-trasdotti nelle cellule bersaglio: uno che codifica per dCas9 cataliticamente inattivo (mutazioni D10A e N863A) fuso al dominio di transattivazione VP64 con un gene di resistenza alla blasticidina; una che codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1 con un gene di resistenza all'igromicina; e una che codifica un sgRNA di 20 nt specifico per il bersaglio fuso a due aptameri di RNA MS2 con un gene di resistenza alla puromicina. A seguito della trasduzione lentivirale e dell'integrazione genomica dei cassetti di espressione, i componenti del SAM vengono espressi in modo stabile e si assemblano nel locus bersaglio all'interno della regione promotrice prossimale a monte del sito di inizio della trascrizione Psmb8, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo cooperativo per reclutare il machinery trascrizionale endogeno e guidare una sovraregolazione sostenuta dell'espressione endogena di LMP7. L'uso di dCas9 inattivo nei confronti delle nucleasi evita l'introduzione di rotture del DNA a doppio filamento e preserva il locus genomico nativo Psmb8 e l'architettura regolatoria.

Il formato lentivirale offre diversi vantaggi pratici: l'integrazione genomica stabile supporta l'attivazione ereditaria attraverso le divisioni cellulari; le preparazioni di particelle ad alto titolo eliminano la necessità di una produzione virale interna; e la compatibilità con tipi di cellule primarie, non in divisione e resistenti alla trasfezione amplia l'accessibilità sperimentale. Il successo della trasduzione può essere confermato e potenziato attraverso una selezione antibiotica tripla utilizzando puromicina, igromicina e blasticidina.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.