LMP7 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-421450-ACT

Psmb8 codifica la subunità catalitica dell’immunoproteasoma murino LMP7 (β5i), un componente chiave del proteasoma 20S inducibile da IFN-γ che rimodella la specificità proteolitica durante l’infiammazione. LMP7 favorisce la generazione di peptidi per l’MHC di classe I e sostiene l’elaborazione e la presentazione dell’antigene, collegando la proteostasi alla sorveglianza immunitaria adattativa. Influenzando programmi infiammatori associati a NF-κB e le risposte cellulari allo stress da citochine, l’attività di Psmb8 incide sulla differenziazione delle cellule immunitarie e sui loro stati di attivazione. Una funzione deregolata dell’immunoproteasoma è stata collegata a una presentazione antigenica aberrante e a fenotipi infiammatori cronici, rendendo Psmb8 un bersaglio rilevante per la ricerca in immunologia e proteostasi nei modelli murini.

LMP7 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Psmb8 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

LMP7 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Psmb8 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Psmb8, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di LMP7. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Psmb8 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da LMP7 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via LMP7 nelle cellule tumorali con espressione di Psmb8 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.