LKLF/KLF2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400918-ACT

KLF2 (LKLF) codifica un fattore di trascrizione a dita di zinco di tipo Krüppel-like che regola la quiescenza endoteliale, il tono vascolare e programmi genici antinfiammatori nelle cellule umane. Integra segnali emodinamici e citochinici per modulare reti trascrizionali legate alla segnalazione dell’ossido nitrico, all’adesione leucocitaria e alla coagulazione, e interagisce con vie come MAPK e NF-κB per plasmare gli stati di attivazione cellulare. Nelle linee immunitarie, KLF2 influenza il traffico cellulare e la differenziazione omeostatica attraverso il controllo dei recettori di adesione e della risposta alle chemochine. Un’attività di KLF2 deregolata è stata associata a fenotipi di infiammazione e rimodellamento vascolare, e un’espressione alterata è stata riportata in molteplici contesti tumorali, in cui la riprogrammazione trascrizionale influisce su proliferazione e programmi correlati alla metastasi.

LKLF/KLF2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di KLF2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

LKLF/KLF2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus KLF2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione KLF2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di LKLF/KLF2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus KLF2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da LKLF/KLF2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via LKLF/KLF2 nelle cellule tumorali con espressione di KLF2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.