LIN-28 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401164-ACT

LIN28A umano codifica LIN-28, una proteina legante l’RNA evolutivamente conservata che regola l’espressione genica post-trascrizionale modulando la stabilità e la traduzione degli mRNA e bloccando selettivamente la maturazione dei microRNA della famiglia let-7. Attraverso l’asse LIN28/let-7, LIN-28 influenza la tempistica dello sviluppo, il mantenimento di stati “stem-like” e la riprogrammazione metabolica, con effetti a valle sui programmi di crescita e differenziamento. L’attività di LIN28A interseca le vie di biogenesi dei miRNA e le reti di segnalazione che orientano le decisioni sul destino cellulare, inclusi contesti legati a proliferazione e pluripotenza. Una regolazione alterata dell’asse LIN28A/let-7 è stata associata alla biologia tumorale e a stati di differenziamento modificati, rendendolo un bersaglio utile per studi meccanicistici delle reti oncogeniche e della regolazione genica nello sviluppo.

LIN-28 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di LIN28A senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

LIN-28 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus LIN28A nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione LIN28A, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di LIN-28. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus LIN28A nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da LIN-28 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via LIN-28 nelle cellule tumorali con espressione di LIN28A silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.