LIFR Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-421433-ACT

Lifr codifica il recettore del leukemia inhibitory factor (LIFR), un recettore per citochine che forma un complesso di segnalazione con gp130 per trasdurre i ligandi della famiglia LIF. Il legame del ligando attiva le vie JAK/STAT, MAPK/ERK e PI3K/AKT, coordinando programmi trascrizionali che regolano le decisioni di destino cellulare, la sopravvivenza e la differenziazione in molteplici tessuti. Nei sistemi murini, la segnalazione mediata da LIFR è ampiamente utilizzata per studiare la biologia delle cellule staminali e progenitrici, i processi di neurosviluppo e l’omeostasi tissutale. Un’attività deregolata della via LIFR è stata associata a fenotipi pertinenti ad anomalie dello sviluppo, segnalazione infiammatoria e programmi oncogeni, a supporto della sua utilità come nodo meccanicistico in reti di segnalazione rilevanti per la malattia.

LIFR Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Lifr senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

LIFR Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Lifr nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Lifr, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di LIFR. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Lifr nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da LIFR nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via LIFR nelle cellule tumorali con espressione di Lifr silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.