LEKTI Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402594-ACT

SPINK5 codifica l’inibitore correlato di tipo Kazal linfo-epiteliale (LEKTI), un inibitore multidominio delle proteasi seriniche che limita l’attività delle callicreine epidermiche per mantenere la coesione dello strato corneo, il controllo della desquamazione e l’integrità della barriera. Modulando l’elaborazione dipendente dalle proteasi dei componenti dei corneodesmosomi, LEKTI influenza i programmi di differenziamento dei cheratinociti e le cascate di segnalazione infiammatoria epidermica. Un’alterazione dell’attività di SPINK5/LEKTI è associata a una funzione compromessa della barriera cutanea e a una maggiore suscettibilità all’infiammazione della pelle, rendendolo rilevante per gli studi sull’omeostasi epiteliale e sull’equilibrio proteasi–antiproteasi. Oltre che nella cute, i profili di espressione di SPINK5 possono essere utili per ricerche sulle risposte epiteliali allo stress e sul rimodellamento guidato dalla proteolisi nei tessuti di barriera.

LEKTI Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SPINK5 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

LEKTI Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SPINK5 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SPINK5, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di LEKTI. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SPINK5 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da LEKTI nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via LEKTI nelle cellule tumorali con espressione di SPINK5 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.