Lefty-A Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403932-ACT

LEFTY2 umano codifica Lefty-A, un antagonista secreto della superfamiglia del TGF-β che modula la segnalazione NODAL/Activin tramite interazioni competitive con complessi recettoriali e regolatori extracellulari correlati. Limitando l’attività della via SMAD2/3, Lefty-A contribuisce al controllo a feedback della specificazione del mesendoderma, alla definizione dell’asse sinistra–destra e, più in generale, all’omeostasi della segnalazione durante lo sviluppo. Un’espressione deregolata di LEFTY2 è stata associata a gradienti di morfogeni aberranti e a programmi di differenziamento cellulare alterati, ed è spesso studiata in contesti che coinvolgono le transizioni epitelio–mesenchimali e la riprogrammazione della segnalazione associata ai tumori. Di conseguenza, LEFTY2 rappresenta un nodo utile per analizzare la dinamica delle vie correlate al TGF-β e gli stati delle reti trascrizionali in sistemi modello umani.

Lefty-A Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di LEFTY2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Lefty-A Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus LEFTY2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione LEFTY2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Lefty-A. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus LEFTY2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Lefty-A nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Lefty-A nelle cellule tumorali con espressione di LEFTY2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.