LASP-1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404630-ACT

LASP1 codifica la proteina 1 contenente domini LIM e SH3 (LASP-1), un adattatore del citoscheletro arricchito nelle adesioni focali, nei lamellipodi e nelle reti di actina associate alla membrana, dove coordina interazioni proteina–proteina che regolano la forma e la motilità cellulare. Collegando i partner di legame all’actina ai complessi di adesione e di segnalazione, LASP-1 influenza processi come migrazione, invasione e rimodellamento dinamico della matrice extracellulare. L’espressione e la localizzazione subcellulare di LASP1 sono spesso studiate nel contesto della transizione epitelio–mesenchimale, del comportamento metastatico e del rimodellamento delle vie di segnalazione delle adesioni. Un’attività deregolata di LASP1 è stata associata ad alterazioni dell’organizzazione del citoscheletro e della segnalazione proliferativa in molteplici tipi di tumore, a supporto del suo utilizzo come nodo funzionale nella ricerca di biologia delle cellule tumorali.

LASP-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di LASP1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

LASP-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus LASP1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione LASP1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di LASP-1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus LASP1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da LASP-1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via LASP-1 nelle cellule tumorali con espressione di LASP1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.