LAMP-2 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400215-ACT

LAMP2 kodiert das lysosomenassoziierte Membranprotein 2 (LAMP-2), ein wichtiges Glykoprotein der Lysosomenmembran, das für die Biogenese und Integrität von Lysosomen erforderlich ist. LAMP-2 unterstützt den autophagischen Fluss sowie lysosomale Abbauwege, einschließlich Makroautophagie und chaperonvermittelter Autophagie, und beeinflusst damit den Umsatz von Proteinen, Lipiden und geschädigten Organellen. Über seine Rolle im endolysosomalen Transport sowie bei Fusionsereignissen wirkt sich LAMP-2 auf zelluläre Stressantworten, metabolische Homöostase und die Antigenprozessierung aus. Eine veränderte LAMP2-Expression oder -Funktion ist mit lysosomalen Speicher- und autophagiebezogenen Phänotypen verknüpft und wurde bei der Danon-Krankheit mit Kardiomyopathie und Skelettmyopathie in Verbindung gebracht, ebenso wie mit weiter gefassten neurodegenerativen und entzündlichen Krankheitsmechanismen, die eine beeinträchtigte lysosomale Clearance einschließen.

LAMP-2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen LAMP2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

LAMP-2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des LAMP2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der LAMP2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen LAMP-2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native LAMP2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von LAMP-2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des LAMP-2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem LAMP2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.