Plasmide CRISPR d'Activation (h) Kindlin-1: sc-412553-ACT

FERMT1 code la kindline-1, un adaptateur d’adhésion focale qui se lie aux queues cytoplasmiques de l’intégrine β afin de favoriser l’activation des intégrines, l’adhésion cellule–matrice et le remodelage du cytosquelette d’actine. La kindline-1 contribue à l’intégrité épithéliale, à la migration des kératinocytes et à l’homéostasie tissulaire en coordonnant la signalisation de l’intégrine-linked kinase, la dynamique des adhésions focales et les voies de mécanotransduction. L’altération de FERMT1 est associée au syndrome de Kindler et a été liée à une signalisation dépendante de l’adhésion perturbée ainsi qu’à un dysfonctionnement de la barrière dans la peau et les épithéliums muqueux. En biologie du cancer et dans des modèles de réparation des plaies, l’expression de la kindline-1 peut moduler le comportement invasif et les interactions avec la matrice extracellulaire via des voies médiées par les intégrines.

Kindlin-1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de FERMT1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Kindlin-1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus FERMT1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription FERMT1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Kindlin-1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus FERMT1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Kindlin-1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Kindlin-1 dans les cellules tumorales présentant une expression de FERMT1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.