Keratin 2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402077-ACT

KRT2 codifica la cheratina 2, una proteina dei filamenti intermedi di tipo II espressa prevalentemente nei cheratinociti soprastrati, dove si appaia con cheratine di tipo I per rafforzare l’integrità del citoscheletro. I filamenti di cheratina 2 si integrano con desmosomi ed emidesmosomi per sostenere la coesione dell’epidermide, la resilienza meccanica e una differenziazione ordinata durante la maturazione dell’epitelio stratificato. Alterazioni dell’espressione di KRT2 o dell’assemblaggio dei filamenti influenzano la dinamica della rete cheratinica, le risposte cellulari allo stress e l’omeostasi della barriera, e sono associate a disordini ereditari della cheratinizzazione caratterizzati da fragilità cutanea. In quanto componente citoscheletrica legata alla differenziazione, KRT2 è ampiamente utilizzato come indicatore molecolare in studi sullo sviluppo epidermico, sulla biomeccanica epiteliale e sul rimodellamento indotto dallo stress.

Keratin 2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di KRT2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Keratin 2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus KRT2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione KRT2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Keratin 2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus KRT2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Keratin 2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Keratin 2 nelle cellule tumorali con espressione di KRT2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.