KCTD13 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404120-ACT

KCTD13 umano codifica una proteina adattatrice contenente un dominio BTB/POZ che assembla complessi di ligasi E3 dell’ubiquitina basati su CUL3, regolando l’ubiquitinazione dei substrati e la proteostasi. Modulando il turnover proteico, KCTD13 è stato collegato al controllo della progressione del ciclo cellulare, della dinamica del citoscheletro e di vie di segnalazione che plasmano lo sviluppo neuronale e la funzione sinaptica. La variazione del dosaggio di KCTD13 nel locus 16p11.2 è associata a fenotipi neuroevolutivi alterati, rendendolo un nodo utile per studiare gli effetti del dosaggio genico e la sensibilità delle vie di segnalazione. La disregolazione della regolazione mediata dall’ubiquitina che coinvolge membri della famiglia KCTD è inoltre rilevante per meccanismi più ampi di omeostasi cellulare e risposte allo stress in sistemi modello.

KCTD13 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di KCTD13 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

KCTD13 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus KCTD13 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione KCTD13, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di KCTD13. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus KCTD13 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da KCTD13 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via KCTD13 nelle cellule tumorali con espressione di KCTD13 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.