JIK Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-408228-ACT

TAOK3 (TAO kinase 3), noto anche come JIK, codifica una chinasi serina/treonina della famiglia STE20 che agisce come regolatore a monte della segnalazione MAPK. TAOK3 partecipa a vie sensibili allo stress, inclusa la modulazione delle cascate p38 e JNK, e contribuisce alla dinamica del citoscheletro, al controllo del ciclo cellulare e alla segnalazione legata all’apoptosi. Attraverso un controllo dipendente dalla fosforilazione di chinasi a valle e proteine scaffold, influenza le risposte trascrizionali allo stress cellulare e ai segnali di crescita. Un’attività o un’espressione deregolata di TAOK3 è stata associata a fenotipi proliferativi e migratori alterati nella biologia dei tumori e a perturbazioni più ampie della segnalazione rilevanti per processi neuroevolutivi e infiammatori.

JIK Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di TAOK3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

JIK Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus TAOK3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione TAOK3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di JIK. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus TAOK3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da JIK nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via JIK nelle cellule tumorali con espressione di TAOK3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.