ITI-H4 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403358-ACT

ITIH4 codifica la catena pesante 4 dell’inibitore inter-α-tripsina (ITI-H4), una glicoproteina secreta, arricchita nel fegato, che circola nel plasma e partecipa alla biologia della matrice extracellulare e a processi infiammatori regolati da proteasi. ITI-H4 è associata alla proteolisi della fase acuta e al rimodellamento di matrici ricche di ialuronano attraverso interazioni all’interno della rete della famiglia degli inter-α-inibitori, influenzando l’omeostasi tissutale durante danno e infiammazione. Un’alterazione dell’espressione o del processamento di ITIH4 è stata riportata in stati infiammatori sistemici e in molteplici firme proteomiche legate al cancro, a sostegno della sua utilità come readout meccanicistico in studi del secretoma associati alla malattia. In modelli cellulari e plasmatici, ITI-H4 rappresenta un nodo facilmente interrogabile per esaminare come i programmi epatici modellino la segnalazione extracellulare, vie adiacenti alla coagulazione e il cross-talk immuno–stromale.

ITI-H4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ITIH4 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

ITI-H4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ITIH4 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ITIH4, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di ITI-H4. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ITIH4 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da ITI-H4 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via ITI-H4 nelle cellule tumorali con espressione di ITIH4 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.