ITI-H2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402683-ACT

L’ITIH2 umano codifica la catena pesante 2 dell’inibitore inter-alfa-tripsina (ITI-H2), una glicoproteina secreta arricchita nel fegato che contribuisce alla stabilizzazione della matrice extracellulare attraverso la formazione di complessi covalenti con l’acido ialuronico, nell’ambito della famiglia degli inibitori inter-alfa. Modulando l’organizzazione dell’acido ialuronico e le reti di inibizione delle proteasi, ITI-H2 influenza il rimodellamento tissutale, i microambienti infiammatori e le interazioni cellula–matrice rilevanti per la risposta alle ferite e per la biologia stromale. Un’alterata abbondanza dei componenti dell’inibitore inter-alfa, incluso ITIH2, è stata associata a un turnover deregolato della matrice extracellulare nella fibrosi e al rimodellamento della matrice associato ai tumori nella biologia del cancro. Queste proprietà rendono ITIH2 un bersaglio utile per studiare l’assemblaggio della matrice dipendente dall’acido ialuronico e i cambiamenti della proteostasi extracellulare legati all’infiammazione.

ITI-H2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ITIH2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

ITI-H2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ITIH2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ITIH2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di ITI-H2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ITIH2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da ITI-H2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via ITI-H2 nelle cellule tumorali con espressione di ITIH2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.