IscU1/2 CRISPR Activationプラスミド (h): sc-402325-ACT

ヒトのISCUは、ミトコンドリアおよび細胞質におけるde novoの鉄・硫黄（Fe–S）クラスター生合成を担う足場（スキャフォールド）タンパク質IscU1/2をコードしており、酸化的リン酸化、TCA回路活性、DNA維持に関与するFe–S依存性酵素の成熟を支えている。IscU1/2は、クラスターをクライアントタンパク質へ受け渡すための一過性の組立プラットフォームとして機能することで、ミトコンドリア代謝をレドックス恒常性および細胞ストレス応答と結び付けている。ISCUの発現量やスプライシングが乱れるとFe–S酵素の機能が障害され、その結果としてエネルギー産生や鉄代謝（鉄の取り扱い）に下流の影響が及び、ミトコンドリアミオパチーや、より広範な神経筋・代謝系の表現型との関連が報告されている。これらの特性から、ISCUはヒト細胞モデルにおいてミトコンドリアのプロテオスタシス、鉄代謝、代謝適応を研究するうえで重要な結節点（ノード）となる。

IscU1/2 CRISPR活性化プラスミド（h）は、基盤となるDNA配列を変更することなく、内因性ISCUの発現を標的化し、非破壊的にアップレギュレートするアプローチを提供します。

IscU1/2 CRISPR 活性化プラスミド (h) は、ヒト細胞株における ISCU 遺伝子座の高効率かつ部位特異的な転写アップレギュレーションのために設計された、3 つのプラスミドからなる相乗的活性化メディエーター (SAM) システムです。このシステムは、DNA結合能を維持しつつヌクレアーゼ活性を失わせる2つの不活性化変異（D10AおよびN863A）を有する、触媒活性のないCas9（dCas9）を中核としています。このdCas9は、強力な転写活性化因子であるVP64と融合しており、選別用のブラスティシジン耐性遺伝子と共に共発現します。2番目のプラスミドは、dCas9-VP64と協調して機能する二次活性化複合体であるMS2-p65-HSF1融合タンパク質をコードしており、ヒグロマイシン耐性遺伝子と共に発現する。3番目のプラスミドは、標的特異的な20塩基対のsgRNAをコードしており、これはMS2-p65-HSF1複合体を活性化部位に誘導する2つのMS2 RNAアプタマーと融合しており、さらにピューロマイシン耐性遺伝子が付随している。これら3つのプラスミドは、システム構成要素すべてが均等に発現するよう、質量比1:1:1で導入される。

標的遺伝子座に集合すると、SAM複合体はISCU転写開始点の上流約200 bpの領域に結合し、そこでVP64、p65、およびHSF1が協調して転写装置を動員し、内因性IscU1/2の発現上昇を促進する。ヌクレアーゼ活性を持つCas9とは異なり、 dCas9は二本鎖切断を導入したりゲノム配列を改変したりしないため、天然のISCU遺伝子座が保持され、内因性遺伝子座におけるIscU1/2依存性の転写応答の研究が可能となります。これにより、機能解析、標的遺伝子の同定、およびISCU発現が沈黙または低下した腫瘍細胞におけるIscU1/2経路の回復のモデル化を行う上で、貴重なツールとなります。

研究用のみ。診断用または治療用ではありません。