IRS-2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400474-ACT

L’IRS2 umano codifica il substrato del recettore dell’insulina 2 (IRS-2), un adattatore citosolico che viene fosforilato su residui di tirosina a valle dei recettori dell’insulina e di IGF1, accoppiando la segnalazione recettoriale alle cascate PI3K–AKT e MAPK. Attraverso il reclutamento di effettori contenenti domini SH2, IRS-2 integra segnali che controllano il metabolismo del glucosio, la crescita cellulare, la sopravvivenza e la differenziazione, con ruoli di rilievo nell’azione insulinica epatica e nella funzione delle cellule β. Alterazioni della segnalazione di IRS2 sono spesso studiate nel contesto della resistenza all’insulina, della disfunzione metabolica associata all’obesità e della riprogrammazione dei circuiti di segnalazione nella biologia dei tumori. IRS-2 interagisce inoltre con input di sensing dei nutrienti e segnali infiammatori che modulano programmi trascrizionali e risposte cellulari allo stress.

IRS-2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di IRS2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

IRS-2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus IRS2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione IRS2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di IRS-2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus IRS2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da IRS-2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via IRS-2 nelle cellule tumorali con espressione di IRS2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.