IPP-1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402634-ACT

PPP1R1A codifica l’inibitore della proteina fosfatasi 1 (IPP-1), un modulatore regolato dalla fosforilazione che si lega a PP1 e ne sopprime l’attività catalitica, contribuendo a definire ampiezza e tempistica della defosforilazione di residui di serina/treonina. Integrando segnali provenienti da cAMP/PKA e da altre vie di chinasi, IPP-1 influenza processi dipendenti dalla fosforilazione, tra cui la regolazione dei canali ionici, la dinamica del citoscheletro e il controllo trascrizionale. L’attività di PPP1R1A è collegata alla segnalazione neuronale e alla plasticità sinaptica attraverso il controllo di substrati dipendenti da PP1, e alterazioni dell’inibizione delle fosfatasi sono state associate a una segnalazione deregolata in contesti neuropsichiatrici e neurodegenerativi. Come nodo dell’equilibrio tra fosfatasi e chinasi, PPP1R1A rappresenta un punto di accesso gestibile per studiare le reti di fosforilazione e il ricollegamento delle vie a valle.

IPP-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PPP1R1A senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

IPP-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PPP1R1A nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PPP1R1A, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di IPP-1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PPP1R1A nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da IPP-1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via IPP-1 nelle cellule tumorali con espressione di PPP1R1A silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.