IP3R-III Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-421194-ACT

Itpr3 codifica il recettore dell’inositolo 1,4,5-trisfosfato di tipo 3 (IP3R-III) nel topo, un canale di rilascio di Ca²⁺ del reticolo endoplasmatico che collega la segnalazione GPCR/PLC alle oscillazioni del calcio intracellulare. Il flusso di Ca²⁺ mediato da IP3R-III regola la secrezione, la polarità epiteliale, il metabolismo mitocondriale e la segnalazione apoptotica, integrando la dinamica del calcio con programmi trascrizionali dipendenti da MAPK e NFAT. Un’alterata espressione di IP3R-III o l’omeostasi del calcio è stata associata a una differenziazione epiteliale e a risposte allo stress deregolate, rendendo Itpr3 un nodo utile per studiare i circuiti di segnalazione del calcio rilevanti per l’infiammazione e i fenotipi associati ai tumori.

IP3R-III Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Itpr3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

IP3R-III Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Itpr3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Itpr3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di IP3R-III. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Itpr3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da IP3R-III nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via IP3R-III nelle cellule tumorali con espressione di Itpr3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.