IP3R-II Particelle di Attivazione Lentivirale (m): sc-421193-LAC

Itpr2 codifica per il recettore dell’inositolo 1,4,5-trifosfato di tipo 2 (IP3R-II), un canale di rilascio del Ca2+ della membrana del reticolo endoplasmatico (RE) che converte i segnali di IP3 generati dalla fosfolipasi C in transitori di Ca2+ citosolici. La mobilizzazione del Ca2+ dipendente da IP3R-II coordina processi quali secrezione, contrattilità, metabolismo ed espressione genica tramite vie sensibili al Ca2+, tra cui la segnalazione della calmodulina, le CaMK, l’asse calcineurina–NFAT e il crosstalk con MAPK. Nei tessuti murini, Itpr2 contribuisce a dinamiche di oscillazione del Ca2+ specifiche del tipo cellulare e all’accoppiamento RE–mitocondri, che modellano le risposte bioenergetiche e allo stress. L’omeostasi del Ca2+ mediata da IP3R, quando disfunzionale, è spesso studiata nel contesto di stress cellulare, alterata eccitabilità e difetti di segnalazione rilevanti per la biologia di malattie neurologiche, cardiovascolari, epiteliali e metaboliche.

Le particelle di attivazione lentivirale IP3R-II (m) rispondono a questa esigenza incapsulando il sistema completo di attivazione trascrizionale del mediatore di attivazione sinergica (SAM) in particelle lentivirali ad alto titolo pronte per la trasduzione, consentendo un'efficiente sovraregolazione di Itpr2 in una gamma più ampia di tipi di cellule umane.

Le particelle di attivazione lentivirale IP3R-II (m) veicolano tutti i componenti funzionali del sistema del mediatore di attivazione sinergica (SAM) tramite trasduzione lentivirale. Il sistema comprende tre preparati di particelle co-trasdotti nelle cellule bersaglio: uno che codifica per dCas9 cataliticamente inattivo (mutazioni D10A e N863A) fuso al dominio di transattivazione VP64 con un gene di resistenza alla blasticidina; una che codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1 con un gene di resistenza all'igromicina; e una che codifica un sgRNA di 20 nt specifico per il bersaglio fuso a due aptameri di RNA MS2 con un gene di resistenza alla puromicina. A seguito della trasduzione lentivirale e dell'integrazione genomica dei cassetti di espressione, i componenti del SAM vengono espressi in modo stabile e si assemblano nel locus bersaglio all'interno della regione promotrice prossimale a monte del sito di inizio della trascrizione Itpr2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo cooperativo per reclutare il machinery trascrizionale endogeno e guidare una sovraregolazione sostenuta dell'espressione endogena di IP3R-II. L'uso di dCas9 inattivo nei confronti delle nucleasi evita l'introduzione di rotture del DNA a doppio filamento e preserva il locus genomico nativo Itpr2 e l'architettura regolatoria.

Il formato lentivirale offre diversi vantaggi pratici: l'integrazione genomica stabile supporta l'attivazione ereditaria attraverso le divisioni cellulari; le preparazioni di particelle ad alto titolo eliminano la necessità di una produzione virale interna; e la compatibilità con tipi di cellule primarie, non in divisione e resistenti alla trasfezione amplia l'accessibilità sperimentale. Il successo della trasduzione può essere confermato e potenziato attraverso una selezione antibiotica tripla utilizzando puromicina, igromicina e blasticidina.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.