IP3R-I Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-421192-ACT

Il gene murino Itpr1 codifica il recettore dell’inositolo 1,4,5-trifosfato di tipo 1 (IP3R-I), un canale di rilascio di Ca2+ del reticolo endoplasmatico che converte i segnali di IP3 generati dalla PLC in transienti di calcio citosolici e degli organelli. IP3R-I regola l’accoppiamento eccitazione–trascrizione, la plasticità sinaptica e il metabolismo mitocondriale dipendente dal Ca2+, modulando la segnalazione a valle attraverso le vie CaMK, calcineurina–NFAT e MAPK. Nei neuroni e in altri tipi cellulari eccitabili, le dinamiche del calcio guidate da IP3R-I influenzano l’integrazione dendritica e l’omeostasi dei circuiti, mentre la loro disregolazione altera le risposte allo stress cellulare e i programmi di espressione genica dipendenti dal calcio. Alterazioni genetiche e funzionali di ITPR1 sono associate a disfunzione cerebellare e a fenotipi neurodegenerativi in sistemi modello, a sostegno della sua rilevanza per lo studio dei meccanismi di segnalazione del calcio in contesti di malattia.

IP3R-I Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Itpr1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

IP3R-I Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Itpr1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Itpr1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di IP3R-I. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Itpr1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da IP3R-I nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via IP3R-I nelle cellule tumorali con espressione di Itpr1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.