Integrin β4/ITGB4/CD104 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400573-ACT

ITGB4 codifica l’integrina β4 (CD104), un recettore di adesione transmembrana che in genere si associa all’integrina α6 formando α6β4, un componente chiave degli emidesmosomi che ancora le cellule epiteliali alla membrana basale ricca di laminina. Tramite l’accoppiamento ai filamenti intermedi e l’interazione con la segnalazione delle adesioni focali e dei fattori di crescita, ITGB4 regola polarità epiteliale, migrazione, sopravvivenza e meccanotrasduzione, con effetti a valle su vie quali PI3K–AKT, MAPK e il rimodellamento del citoscheletro. Alterazioni dell’espressione o della localizzazione di ITGB4 sono associate a una compromissione dell’adesione cellula–matrice, a un aumento del comportamento invasivo e al rimodellamento delle barriere epiteliali in diversi contesti patologici. Poiché α6β4 integra i segnali della matrice extracellulare con la segnalazione intracellulare, è ampiamente studiata nella segnalazione dipendente dall’adesione, nei programmi associati all’EMT e nelle interazioni con il microambiente tumorale.

Integrin β4/ITGB4/CD104 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ITGB4 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Integrin β4/ITGB4/CD104 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ITGB4 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ITGB4, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Integrin β4/ITGB4/CD104. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ITGB4 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Integrin β4/ITGB4/CD104 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Integrin β4/ITGB4/CD104 nelle cellule tumorali con espressione di ITGB4 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.