INF2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-410096-ACT

INF2 umano (inverted formin 2) codifica un fattore di nucleazione dell’actina che collega la segnalazione delle GTPasi della famiglia Rho al rimodellamento dinamico del citoscheletro di actina e ai relativi eventi di traffico di membrana. INF2 partecipa a processi che includono l’organizzazione delle fibre di stress, la regolazione dei contatti tra reticolo endoplasmatico e mitocondri e la fissione mitocondriale tramite una polimerizzazione dell’actina coordinata. Un’alterazione dell’attività di INF2 è stata collegata a una disregolazione dell’omeostasi del citoscheletro e della polarità cellulare, ed è associata a fenotipi rilevanti per la malattia nei podociti renali e nei neuroni periferici. In quanto nodo di via che integra la dinamica dell’actina con la funzione degli organelli, INF2 è studiato di routine in modelli di disturbi del citoscheletro e del rimodellamento della rete mitocondriale.

INF2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di INF2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

INF2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus INF2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione INF2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di INF2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus INF2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da INF2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via INF2 nelle cellule tumorali con espressione di INF2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.