INDOL1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403856-ACT

L’IDO2 umano (indoleamina 2,3-diossigenasi 2; INDOL1) è un enzima eme-dipendente coinvolto nel catabolismo del triptofano, che contribuisce al flusso della via della chinurenina e al controllo locale della disponibilità di aminoacidi. Modulando la deplezione di triptofano e i metaboliti della chinurenina a valle, IDO2 può influenzare le risposte cellulari allo stress, l’equilibrio redox e i programmi di segnalazione immunoregolatoria. L’attività di IDO2 interseca vie che modellano la presentazione dell’antigene, la produzione di mediatori infiammatori e l’adattamento metabolico, rendendola rilevante per studi su evasione immunitaria, infiammazione cronica e immunometabolismo associato al tumore. La disregolazione degli enzimi della via della chinurenina, inclusa IDO2, è stata associata ad alterazioni del tono immunitario e a fenotipi metabolici osservati in diversi contesti di cancro e malattie infiammatorie.

INDOL1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di IDO2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

INDOL1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus IDO2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione IDO2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di INDOL1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus IDO2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da INDOL1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via INDOL1 nelle cellule tumorali con espressione di IDO2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.