IKK alpha Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400492-ACT

CHUK codifica IKK alfa (IKKα), una subunità catalitica del complesso della chinasi IκB che integra segnali a monte provenienti dalle vie del recettore del TNF, dei recettori Toll-like e dei recettori dell’antigene per regolare i programmi trascrizionali di NF-κB. IKKα è essenziale per la via non canonica di NF-κB attraverso la fosforilazione di NFKB2/p100 e sostiene la segnalazione p52–RelB, che influenza l’organogenesi degli organi linfoidi, la differenziazione delle cellule immunitarie e l’espressione di geni infiammatori. Oltre a NF-κB, IKKα partecipa al crosstalk con la segnalazione MAPK e con vie correlate agli interferoni ed è stata collegata a funzioni associate alla cromatina che influenzano il controllo trascrizionale. Un’attività deregolata di CHUK/IKKα è associata a infiammazione aberrante, disfunzione immunitaria e reti di segnalazione rilevanti per il cancro, rendendola un bersaglio frequente per studi meccanicistici sulla regolazione delle vie di segnalazione e sulla trascrizione in risposta allo stress.

IKK alpha Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CHUK senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

IKK alpha Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CHUK nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CHUK, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di IKK alpha. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CHUK nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da IKK alpha nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via IKK alpha nelle cellule tumorali con espressione di CHUK silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.