IDH3A Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404788-ACT

IDH3A codifica la subunità alfa dell’isocitrato deidrogenasi 3 mitocondriale, un enzima dipendente da NAD+ che catalizza la decarbossilazione ossidativa dell’isocitrato in α-chetoglutarato nel ciclo dell’acido tricarbossilico (TCA). Regolando la produzione mitocondriale di NADH, IDH3A supporta la fosforilazione ossidativa, l’equilibrio redox e l’accoppiamento metabolico tra glicolisi e vie biosintetiche. Alterazioni dell’attività e dell’espressione di IDH3A sono state associate a riprogrammazione metabolica, disfunzione mitocondriale e fenotipi proliferativi, rendendolo un nodo rilevante per lo studio del metabolismo energetico e delle risposte allo stress. Le vie associate a IDH3A intersecano la segnalazione dell’ipossia, la gestione delle specie reattive dell’ossigeno e il flusso di carbonio verso substrati anaplerotici ed epigenetici derivati dall’α-chetoglutarato.

IDH3A Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di IDH3A senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

IDH3A Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus IDH3A nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione IDH3A, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di IDH3A. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus IDH3A nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da IDH3A nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via IDH3A nelle cellule tumorali con espressione di IDH3A silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.