Id1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400341-ACT

L’ID1 umano codifica Id1, un regolatore trascrizionale helix–loop–helix (HLH) privo di un dominio di legame al DNA, che modula l’espressione genica sequestrando le E-proteine e altri fattori bHLH. Limitando i programmi trascrizionali specifici di linea, Id1 contribuisce a controllare proliferazione, differenziamento e plasticità cellulare, ed è spesso regolato a valle della segnalazione della famiglia BMP/TGF-β e delle relative reti trascrizionali dipendenti da SMAD. L’attività di ID1 è associata a stati di sviluppo e “stem-like”, con ruoli dipendenti dal contesto nella progressione del ciclo cellulare, nella migrazione e nelle risposte allo stress. Un’espressione deregolata di ID1 è riportata in molteplici modelli rilevanti per la malattia, in cui alterazioni del differenziamento e dell’equilibrio dei segnali possono contribuire a rimodellamento tissutale aberrante e a fenotipi oncogenici.

Id1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ID1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Id1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ID1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ID1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Id1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ID1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Id1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Id1 nelle cellule tumorali con espressione di ID1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.